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PCR產物瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法
瀏覽次數:839發布日期:2023-07-17

PCR產物瓊脂糖凝膠與聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測方法:

PCR產物的檢測方法:

一、瓊脂糖凝膠電泳
  這是實驗室zui 常用的方法,簡便易行,只需少量DNA即可進行實驗。其原理是不同大小的DNA分子通過瓊脂糖凝膠時,由于泳動速度不同而被分離,經溴化乙錠(EB)染色,在紫外光照射下DNA分子發出熒光而判定其分子的大小。

用于電泳檢測PCR產物的瓊脂糖濃度常為1%—2%,應該使用純度高的電泳純級瓊脂糖,這種瓊脂糖已除去了熒光抑制劑及核酸酶等雜質。

(1)制膠

瓊脂糖凝膠厚度約為3~5mm。過薄則加樣孔樣品會溢出來,過厚觀察時熒光穿透不強以至有些小片段DNA帶型不易分辨。如配制2%凝膠100ml,稱取瓊脂糖2g于三角瓶中,加入100ml 0.5×TBE液,微波爐加熱2-5min,使瓊脂糖wan 全溶解(注意不要暴沸),置室溫等溫度下降至60℃時,加入終濃度0.5μg/ml的EB液,充分混勻后倒板(注意排除氣體)。

(2)加樣和電泳

上樣時一般取PCR反應液5~10μl,加入3μl溴酚蘭液,充分混勻,加入凝膠加樣孔中。電泳儀可用一般穩壓可調中壓電泳儀,電泳工作液為0.5×TBE液,接通電源,使樣品由負極向正極移動。60-100V恒壓電泳約30-60分鐘。

(3)檢測

將凝膠板放在紫外透射儀的石英玻璃臺上進行檢測,DNA產物與熒光染料EB形成橙黃色熒光復合物。觀察各泳道是否有橙黃色熒光帶出現,并與擴增時所設的陽性對照比較,判斷陽性或陰性結果。也可在電泳時以標準分子量作對照,判斷其擴增片段是否與設計的大小相一致。

二、聚丙烯酰胺凝膠電泳
  聚丙烯酰胺凝膠電泳比瓊脂糖凝膠電泳繁瑣,但在引物純化、PCR擴增指紋圖、多重PCR擴增、PCR擴增產物的酶切限制性長度多態性分析時常用到。

聚丙烯酰胺凝膠電泳分辨DNA片段的有效范圍:

(1)制膠
在兩塊制膠玻璃板中間放上墊片,放上制膠架,擰緊制膠螺絲夾緊玻璃板。

制備適量合適濃度的凝膠,使之略多于膠板。

不同濃度(%)聚丙酰胺凝膠的制法:

在加入TEMED和10%過硫酸銨后,立即混勻,倒入放置45℃角的玻璃板內,wan 全注滿(注意不要有氣泡),迅速將玻璃板放置水平位置。立即放成型梳子于腔頂并夾緊,待30-60分鐘膠聚合后,取下膠板,放入電泳槽中固定。

(2)加樣和電泳
上下槽中加入1×TBE電泳緩沖液,溢過加樣孔,拔出梳子,排出加樣孔中的氣泡,將PCR產物或限制性內切酶消化產物2與1上樣緩沖液混勻,用微量注射器加入加樣孔底部,使樣品在孔底成一層,兩側孔中加入標準分子量的DNA Marker。

以2-10V/cm電壓電泳,電泳時間足夠長,使片斷足以分開,待指示劑走到適宜位置時關閉電源,將膠片取出。

(3)銀染
分開兩塊玻璃板,將(jiang)凝膠(jiao)片(pian)放入(ru)100ml銀(yin)染固(gu)定(ding)液中(zhong)(zhong)振蕩15min,雙蒸(zheng)水洗3次,每次2min,然(ran)后將(jiang)凝膠(jiao)片(pian)轉入(ru)100ml 0.2%的AgNO3中(zhong)(zhong)于搖床上染色約(yue)10min,吸(xi)去AgNO3液,用雙蒸(zheng)水洗3次,每次30s,加(jia)入(ru)100ml顯(xian)色液約(yue)7-10min,待(dai)DNA帶顯(xian)示(shi)清除時(shi),吸(xi)去顯(xian)色液,加(jia)入(ru)固(gu)定(ding)液Na2CO3,靜置(zhi)2-3min,取出凝膠(jiao)觀察(cha)。