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細胞周期的測定原理及步驟
瀏覽次數:622發布日期:2023-07-06


一、原理

  細(xi)(xi)(xi)胞(bao)周期指(zhi)細(xi)(xi)(xi)胞(bao)一(yi)個世(shi)代所經歷的時間。從(cong)一(yi)次細(xi)(xi)(xi)胞(bao)分裂(lie)結束(shu)到下一(yi)次分裂(lie)結束(shu)為一(yi)個周期。細(xi)(xi)(xi)胞(bao)周期反應了細(xi)(xi)(xi)胞(bao)增殖速度。

單個細胞的周期測(ce)定可采用縮時攝影的方(fang)法,但它不能代表細胞群(qun)體(ti)的周期,故現多采用其他方(fang)法測(ce)群(qun)體(ti)周期。

測定(ding)細(xi)胞(bao)周期的方法(fa)很多(duo),有同位素標(biao)記法(fa)、細(xi)胞(bao)計(ji)數法(fa)等,這里介紹一種(zhong)利用BrdU滲入測定(ding)細(xi)胞(bao)周期的方法(fa)。

BrdU(5-溴(xiu)脫氧(yang)尿嘧啶(ding)核苷)加入培養基后(hou),可(ke)做為細胞DNA復制的原料,經(jing)過兩(liang)個(ge)細胞周(zhou)(zhou)期后(hou),細胞中兩(liang)條(tiao)單(dan)鏈(lian)均含BrdU的DNA將占l/2,反映在染(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)上應表(biao)現為一(yi)(yi)(yi)(yi)條(tiao)單(dan)體(ti)(ti)(ti)淺染(ran)。如(ru)經(jing)歷了(le)(le)三個(ge)周(zhou)(zhou)期,則染(ran)色(se)體(ti)(ti)(ti)中約一(yi)(yi)(yi)(yi)半為兩(liang)條(tiao)單(dan)體(ti)(ti)(ti)均淺染(ran),另(ling)一(yi)(yi)(yi)(yi)半為一(yi)(yi)(yi)(yi)深一(yi)(yi)(yi)(yi)淺。細胞如(ru)果僅經(jing)歷了(le)(le)一(yi)(yi)(yi)(yi)個(ge)周(zhou)(zhou)期,則兩(liang)條(tiao)單(dan)體(ti)(ti)(ti)均深染(ran)。計分裂相中各(ge)期比例,就可(ke)算出細胞周(zhou)(zhou)期的值。

二、儀器、用品與試劑

1、儀器、用品:同常規(gui)細胞培養(yang)

2、試劑:BrdU(1.0mg/ml),甲醇、冰(bing)醋酸,Giemsa染液(ye),秋水(shui)仙(xian)素,2×SSC液(ye)

三、操作步驟

1、細胞生長(chang)至指數(shu)期時,向培(pei)養(yang)液中加入BrdU,使終濃度(du)為10μg/ml。

2、44小時加(jia)秋水仙素(su),使每ml中含0.1μg。

3、48小時后常規消化細(xi)(xi)胞至離心管中(zhong),注意培養上清的漂浮細(xi)(xi)胞也要(yao)收集到離心管中(zhong)。

4、常規(gui)染(ran)色體制片(見第三(san)部(bu)分:染(ran)色體技術)。

5、染色體玻片置56℃水浴(yu)鍋蓋(gai)上,鋪上2×SSC 液,距(ju)紫外燈管(guan)6cm處(chu)紫外照射30分鐘。

6、棄去2×SSC液,流水沖洗(xi)。

7、Giemsa液(ye)染(ran)色10分(fen)鐘(zhong),流(liu)水(shui)沖(chong)洗,晾干。

8、鏡檢100個分裂相,計(ji)、二、三、四細(xi)胞(bao)期分裂指數。

9、計算(suan): 細胞(bao)周(zhou)期(Tc)=48/(小時(shi))

附:(1)BrdU配制: BrdU 10mg十(shi)雙蒸水10ml 4℃下(xia)避(bi)光保(bao)存。

(2)2×SSC配制: NaCl 1.75克,檸(ning)檬酸三鈉•2H2O 0.88克,加水(shui)至100ml,4℃保(bao)存。