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ELISA檢測出現灰區結果原因分析
瀏覽次數:1935發布日期:2023-06-26

  ELISA 測(ce)定(ding)的(de)(de)(de)陽(yang)性(xing)(xing)判(pan)斷(duan)值, 通常是將大量陰性(xing)(xing)和陽(yang)性(xing)(xing)人群的(de)(de)(de)測(ce)定(ding)數(shu)據(ju)進行(xing)統計(ji)分析(xi)(xi)后(hou)確定(ding)的(de)(de)(de), 其(qi)確定(ding)依據(ju)為判(pan)斷(duan)結(jie)果的(de)(de)(de)假陽(yang)性(xing)(xing)和假陰性(xing)(xing)率(lv)最(zui)di。在(zai)陽(yang)性(xing)(xing)判(pan)斷(duan)值周圍(wei)一(yi)定(ding)范圍(wei)內之外(wai)的(de)(de)(de)測(ce)定(ding)結(jie)果可歸(gui)為可疑(yi), 亦即ELISA 測(ce)定(ding)的(de)(de)(de)“灰(hui)(hui)區(qu)”。“灰(hui)(hui)區(qu)”的(de)(de)(de)大小可用(yong)統計(ji)學方(fang)法確定(ding)。測(ce)定(ding)結(jie)果處于“灰(hui)(hui)區(qu)”的(de)(de)(de)樣本, 可通過確認(ren)試驗或(huo)追蹤(zong)檢測(ce)來確定(ding)到底是陽(yang)性(xing)(xing)還(huan)是陰性(xing)(xing)ELISA“灰(hui)(hui)區(qu)”是把(ba)定(ding)量分析(xi)(xi)的(de)(de)(de)正常值范圍(wei)引入(ru)定(ding)性(xing)(xing)分析(xi)(xi)而建立(li)的(de)(de)(de)概(gai)念。灰(hui)(hui)區(qu)的(de)(de)(de)設置(zhi)有二種: (1)CO × (1±C) , C 為該試劑的(de)(de)(de)批(pi)內C (一(yi)般在(zai)15%~ 20% 間) ; (2)CO ±2S, S 為做室內ROC 的(de)(de)(de)S。

  

  另(ling)外(wai), 個(ge)(ge)人認為: ELISA“灰(hui)區(qu)”對于不(bu)同項目和應用的(de)領域不(bu)同, 其設置不(bu)能(neng)一(yi)概而論。根據美國疾病控制中心(xin) (CDC) 對美國Ortho 的(de)抗(kang)HC 檢測的(de)ELISA 試劑盒進行研究, 發現只有檢驗結果S/CO ≥318 時, 高度預示HC 抗(kang)體真陽(yang)性狀(zhuang)態; 若檢驗結果S/CO < 318, 存(cun)在較高的(de)假陽(yang)性。在血站系統的(de)獻血員抗(kang)HC 篩查用上述兩種灰(hui)區(qu)的(de)設置方法沒有什么(me)不(bu)可; 如(ru)果臨床實驗室抗(kang)HC 的(de)灰(hui)區(qu)也按前者設置,勢必(bi)存(cun)在較多的(de)假陽(yang)性。ELISA 質量保證是(shi)一(yi)個(ge)(ge)復雜的(de)過程, 許(xu)多重要的(de)環節都(dou)影(ying)響(xiang)到檢測的(de)質量。現分析如(ru)下(xia)。

 

1 、方法學的影響

 ELISA 測(ce)定模式包括以(yi)下幾(ji)種: 雙抗(kang)體(ti)夾心(xin)(xin)法(fa)、間接法(fa)、雙抗(kang)原夾心(xin)(xin)法(fa)、IgM 抗(kang)體(ti)捕捉法(fa)、競(jing)爭(zheng)抑制法(fa), 其中競(jing)爭(zheng)抑制法(fa)因受(shou)操作時差所引起(qi)的(de)bu&nbsp;公平(ping)競(jing)爭(zheng)等因素的(de)影響, 結果重復(fu)性(xing)較差, 質量較難控(kong)制。

 

2 、試劑因素

試(shi)劑(ji)的(de)(de)選(xuan)(xuan)擇(ze) 檢(jian)測的(de)(de)原理均基于抗原抗體(ti)反應。由于該(gai)反應過程(cheng)受多種因(yin)素的(de)(de)影響, 如(ru)普遍存在(zai)基質(zhi)(zhi)效應、交叉反應等, 因(yin)而檢(jian)測結果難以溯源, 不同方法、不同試(shi)劑(ji)之(zhi)間甚至同一試(shi)劑(ji)不同批號間結果均缺乏(fa)可比性。試(shi)劑(ji)質(zhi)(zhi)量在(zai)很大(da)程(cheng)度上決定(ding)了檢(jian)測的(de)(de)水(shui)平, 因(yin)此在(zai)引入新項目(mu)之(zhi)前必須對試(shi)劑(ji)進(jin)(jin)行(xing)嚴(yan)格的(de)(de)評估。試(shi)劑(ji)的(de)(de)評估有以下幾個步驟(zou): (1) 確定(ding)開(kai)展該(gai)項目(mu)的(de)(de)必要性; (2) 了解(jie)該(gai)項目(mu)現有的(de)(de)檢(jian)測方法和原理; (3) 在(zai)了解(jie)試(shi)劑(ji)的(de)(de)組成基礎上選(xuan)(xuan)擇(ze)多家(jia)試(shi)劑(ji)盒(he)進(jin)(jin)行(xing)比較,判斷標準shou 選(xuan)(xuan)參考(kao)方法或參考(kao)物(wu)質(zhi)(zhi), 其次為臨床的(de)(de)滿意度及權wei 機構(gou)的(de)(de)報告如(ru)各級室間質(zhi)(zhi)量評價、CDC 報告等; (4) 定(ding)期對檢(jian)測結果進(jin)(jin)行(xing)追蹤(zong)反饋直至最終(zhong)認可該(gai)試(shi)劑(ji)。

 

3、樣本因素

  標(biao)本(ben)(ben)(ben)干(gan)擾(rao)因(yin)(yin)(yin)素(su)(su)包(bao)括內(nei)源性(xing)(xing)(xing)干(gan)擾(rao)因(yin)(yin)(yin)素(su)(su)和外(wai)源性(xing)(xing)(xing)干(gan)擾(rao)因(yin)(yin)(yin)素(su)(su),前者包(bao)括類風濕因(yin)(yin)(yin)子、補體、異嗜(shi)性(xing)(xing)(xing)抗體、自身抗體、溶菌酶等(deng), 后者包(bao)括標(biao)本(ben)(ben)(ben)溶血(xue)、標(biao)本(ben)(ben)(ben)被污(wu)染、標(biao)本(ben)(ben)(ben)貯存(cun)時間過(guo)(guo)長、標(biao)本(ben)(ben)(ben)凝固不全、冷凍標(biao)本(ben)(ben)(ben)的反(fan)復凍融(rong)等(deng)。其中(zhong)外(wai)源性(xing)(xing)(xing)干(gan)擾(rao)因(yin)(yin)(yin)素(su)(su)是我們在(zai)檢測(ce)過(guo)(guo)程中(zhong)可(ke)以避(bi)免也是必(bi)須避(bi)免的因(yin)(yin)(yin)素(su)(su), 而避(bi)免內(nei)源性(xing)(xing)(xing)因(yin)(yin)(yin)素(su)(su)的干(gan)擾(rao)則主要(yao)通過(guo)(guo)選擇合適的試劑盒(he)。在(zai)臨床(chuang)中(zhong)遇到少見(jian)的疑(yi)難病例時應當考慮到內(nei)源性(xing)(xing)(xing)干(gan)擾(rao)因(yin)(yin)(yin)素(su)(su)的存(cun)在(zai)。以下對外(wai)源性(xing)(xing)(xing)干(gan)擾(rao)因(yin)(yin)(yin)素(su)(su)進行簡(jian)要(yao)說明:

 

  標本溶(rong)血 要注意(yi)避免出(chu)現(xian)嚴重溶(rong)血。血紅(hong)蛋白(bai)(bai)中(zhong)(zhong)含(han)有血紅(hong)素(su)基團(tuan), 其具(ju)有類過氧(yang)化(hua)物的(de)活性(xing), 因此, 在以辣根過氧(yang)化(hua)物酶(ho rseradish peroxidase,HRP) 為標記酶的(de)ELISA 測定中(zhong)(zhong), 如果血清標本中(zhong)(zhong)血紅(hong)蛋白(bai)(bai)濃度(du)較高, 則其就(jiu)很(hen)容易在溫育過程中(zhong)(zhong)吸附于固相(xiang), 從(cong)而與(yu)后面加入的(de)底物反應(ying)顯色(se)。

 

4、操作因素對ELISA 結果的影響

  ELISA 測(ce)定一般遵循以下步(bu)驟: 固相包被→加(jia)樣品→溫育(yu)→洗滌→加(jia)酶結合物(wu)→溫育(yu)→洗滌→加(jia)底物(wu)→溫育(yu)→顯色(se)→終止顯色(se)→比(bi)色(se)

目(mu)前各種形式的(de)ELISA 自動(dong)(dong)(dong)分析儀(yi)已經(jing)進(jin)入市場, 如廣泛(fan)應(ying)用于血(xue)站系(xi)統的(de)微板式全自動(dong)(dong)(dong)酶免(mian)分析儀(yi), 其(qi)(qi)(qi)試劑(ji)(ji)(ji)為開(kai)放(fang)式的(de), 而(er)對(dui)于其(qi)(qi)(qi)它類(lei)型的(de), 則試劑(ji)(ji)(ji)和(he)(he)儀(yi)器(qi)往(wang)往(wang)是(shi)配套的(de)。但當前大(da)部分醫學(xue)實(shi)驗(yan)室(shi)均(jun)(jun)采用手工操(cao)(cao)(cao)作(zuo)加(jia)儀(yi)器(qi)測(ce)定的(de)方式。ELISA 操(cao)(cao)(cao)作(zuo)步(bu)驟(zou)復雜, 操(cao)(cao)(cao)作(zuo)不(bu)當將引起較大(da)的(de)誤差(cha)(cha)。以下敘述各個(ge)(ge)(ge)步(bu)驟(zou)中的(de)影響因(yin)素。加(jia)樣器(qi)是(shi)一種比(bi)較精密的(de)工具, 其(qi)(qi)(qi)在長(chang)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)使用時(shi)(shi)(shi)會因(yin)機(ji)械磨損或(huo)者推動(dong)(dong)(dong)桿(gan)內附著血(xue)痂(jia)等(deng)原因(yin)造成加(jia)樣不(bu)準(zhun), 尤(you)其(qi)(qi)(qi)是(shi)對(dui)于樣本(ben)量較大(da)的(de)臨床實(shi)驗(yan)室(shi), 因(yin)此必須定期(qi)對(dui)加(jia)液器(qi)進(jin)行維護和(he)(he)校準(zhun)。每次加(jia)不(bu)同(tong)的(de)標(biao)(biao)本(ben)時(shi)(shi)(shi)均(jun)(jun)需更換吸嘴, 以免(mian)發生(sheng)交叉污(wu)染(ran)。加(jia)樣時(shi)(shi)(shi)速(su)度(du)不(bu)可(ke)太快(kuai), 避免(mian)將標(biao)(biao)本(ben)加(jia)在孔(kong)壁上部, 并注意不(bu)要濺出或(huo)產(chan)生(sheng)氣泡。加(jia)樣時(shi)(shi)(shi)還應(ying)當注意操(cao)(cao)(cao)作(zuo)時(shi)(shi)(shi)差(cha)(cha)對(dui)結(jie)果(guo)(guo)的(de)影響, 操(cao)(cao)(cao)作(zuo)時(shi)(shi)(shi)差(cha)(cha)是(shi)指加(jia)入標(biao)(biao)本(ben)、試劑(ji)(ji)(ji)及混(hun)勻時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)的(de)差(cha)(cha)異(yi)。操(cao)(cao)(cao)作(zuo)時(shi)(shi)(shi)差(cha)(cha)在每個(ge)(ge)(ge)實(shi)驗(yan)中都存(cun)在, 尤(you)其(qi)(qi)(qi)是(shi)手工操(cao)(cao)(cao)作(zuo), 日常檢(jian)(jian)測(ce)標(biao)(biao)本(ben)多(duo)達(da)幾(ji)百個(ge)(ge)(ge),從加(jia)入第一個(ge)(ge)(ge)標(biao)(biao)本(ben)到最(zui)后(hou)一個(ge)(ge)(ge)標(biao)(biao)本(ben), 需幾(ji)十分鐘(zhong), 加(jia)入試劑(ji)(ji)(ji)及混(hun)勻等(deng)均(jun)(jun)存(cun)在著前后(hou)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)差(cha)(cha)異(yi), 使抗(kang)原抗(kang)體(ti)反應(ying)和(he)(he)酶促反應(ying)時(shi)(shi)(shi)間(jian)(jian)不(bu)一致, 操(cao)(cao)(cao)作(zuo)時(shi)(shi)(shi)差(cha)(cha)對(dui)競(jing)爭法(fa)檢(jian)(jian)測(ce)的(de)結(jie)果(guo)(guo)影響更大(da), 在加(jia)酶結(jie)合物和(he)(he)底物時(shi)(shi)(shi)可(ke)用定量多(duo)道(dao)。