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PCR反應被污染操作規程
瀏覽次數:1550發布日期:2023-06-13

 進(jin)行PCR操作時,操作人員(yuan)應該嚴格遵(zun)守一些(xie)操作規(gui)程,最da 程度地(di)降(jiang)低可能出現(xian)的PCR污(wu)染或杜絕污(wu)染的出現(xian)。

1.劃分操作區:

目前,普通PCR尚不能(neng)做到(dao)單(dan)(dan)人單(dan)(dan)管,實現wan 全(quan)閉管操作(zuo),但(dan)無(wu)論(lun)是(shi)否能(neng)夠達到(dao)單(dan)(dan)人單(dan)(dan)管,均要求實驗操作(zuo)在三個不同的區域(yu)內(nei)進行(xing),PCR的前處理和(he)后處理要在不同的隔離(li)區內(nei)進行(xing):

(1)標(biao)本處理(li)區,包括擴增摸板的制備。

(2)擴(kuo)增(zeng)區,包括反應(ying)液(ye)的配制和(he)PCR擴(kuo)增(zeng)。

(3)產物分析(xi)區,凝膠電泳分析(xi),產物拍照及重(zhong)組克隆的制備。

(4)各(ge)工作(zuo)(zuo)區要(yao)有(you)一定(ding)的(de)隔離,操(cao)作(zuo)(zuo)器材專用,要(yao)有(you)一定(ding)的(de)方(fang)向性(xing)。如:標本制(zhi)備→PCR擴增(zeng)→產物分析→產物處理。

切(qie)記:產物分(fen)析(xi)區(qu)的產物及器材不要拿(na)到其他兩(liang)個工作區(qu)。

2.分裝(zhuang)試劑:

PCR擴增所(suo)需要的試劑均應(ying)在裝有紫外燈(deng)的超凈(jing)工(gong)作臺(tai)或負壓工(gong)作臺(tai)配制(zhi)和(he)分裝。所(suo)有的加(jia)樣器和(he)吸頭需固定放(fang)于其(qi)中,不能用來(lai)吸取擴增后的DNA和(he)其(qi)他來(lai)源的DNA:

(1) PCR用水應為高壓(ya)的(de)雙蒸水。

(2) 引物(wu)(wu)和dNTP用高壓的雙蒸水在無PCR擴(kuo)增產物(wu)(wu)區配制。

(3)引物和(he)dNTP應分裝(zhuang)儲存,分裝(zhuang)時(shi)應標(biao)明時(shi)間,以備(bei)發生污染時(shi)查找(zhao)原因(yin)。

3. 實驗操(cao)作注意事(shi)項(xiang):

盡管(guan)擴增序列的殘留污(wu)染大部分是(shi)假陽性(xing)反應的原因(yin),樣(yang)(yang)品間的交叉污(wu)染也是(shi)原因(yin)之(zhi)一。因(yin)此(ci),不僅要在(zai)進行擴增反應是(shi)謹慎認真(zhen),在(zai)樣(yang)(yang)品的收(shou)集、抽提和擴增的所有環節都應該注意(yi):

(1)戴一次性(xing)手套,若不小心(xin)濺上反應液,立即(ji)更換(huan)手套。

(2)使用一次性吸頭(tou),嚴禁與(yu)PCR產物分析室的吸頭(tou)混用,吸頭(tou)不要長時間暴露于空氣中,避免氣溶膠的污染。

(3)避免反應(ying)(ying)液飛濺(jian),打開反應(ying)(ying)管(guan)時為避免此種情(qing)況(kuang),開蓋前(qian)稍離心(xin)收集液體于管(guan)底。若不小心(xin)濺(jian)到手套(tao)或桌面(mian)(mian)上,應(ying)(ying)立刻(ke)更(geng)換手套(tao)并用稀酸擦拭桌面(mian)(mian)。

(4)操作多(duo)份(fen)樣品時(shi),制備反(fan)應(ying)混合液,先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好,然(ran)后分裝,這樣即可以減少操作,避免(mian)污染,又可以增加反(fan)應(ying)的精確度。

(5)最后加入(ru)反應模(mo)板,加入(ru)后蓋緊反應管。

(6)操作時設立陰陽性(xing)對(dui)照和空白對(dui)照,即可(ke)驗證PCR反應(ying)的(de)可(ke)靠(kao)性(xing),又可(ke)以協助判斷擴增系統的(de)可(ke)信性(xing)。

(7)盡(jin)可能用(yong)可替換或(huo)可高壓處理(li)的加(jia)樣(yang)器(qi)(qi),由于(yu)加(jia)樣(yang)器(qi)(qi)最容易受產物氣溶膠或(huo)標本(ben)DNA的污染,最好使(shi)用(yong)可替換或(huo)高壓處理(li)的加(jia)樣(yang)器(qi)(qi)。如沒(mei)有這種特殊的加(jia)樣(yang)器(qi)(qi),至少PCR操作(zuo)過程中加(jia)樣(yang)器(qi)(qi)應該專用(yong),不能交叉使(shi)用(yong),尤其是PCR產物分析所用(yong)加(jia)樣(yang)器(qi)(qi)不能拿(na)到其它兩(liang)個區。

(8)重復實驗,驗證結果,慎下結論。